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Aug 09, 2023

Sfide e soluzioni nella progettazione dei test PCR

Credito: Sebastian Condrea / Getty Images La progettazione di test PCR riproducibili implica l'ottimizzazione di più bersagli mobili, dalla standardizzazione di ciascun componente in volumi di reazione, talvolta minuti, alla

Credito: Sebastian Condrea/Getty Images

La progettazione di test PCR riproducibili implica l'ottimizzazione di più bersagli mobili, dalla standardizzazione di ciascun componente in volumi di reazione talvolta minimi alla pianificazione anticipata per garantire la conservazione sicura e a lungo termine di reagenti, campioni e prodotti PCR.

Apprezzare le complessità e le sfide comuni coinvolte nello sviluppo e nell’ottimizzazione dei test diagnostici basati sulla PCR aiuterà i ricercatori a superare tali ostacoli utilizzando le ultime soluzioni disponibili. Qui discutiamo alcune delle sfide comuni che i ricercatori potrebbero incontrare durante la progettazione di un test diagnostico molecolare basato sulla PCR e alcune potenziali soluzioni.

Una delle prime sfide che si incontrano nella progettazione di una reazione PCR è la scelta della polimerasi ottimale per l'applicazione. È fondamentale valutare le esigenze nel contesto delle caratteristiche del campione biologico, della lunghezza della sequenza da amplificare e dell'accuratezza della sequenza desiderata del prodotto amplificato.

Gerald Hunter, PhD, scienziato delle applicazioni sul campo presso Fortis Life Sciences, che ha una vasta esperienza nell'ottimizzazione dei test PCR, afferma: "Diverse DNA polimerasi hanno specificità, funzioni enzimatiche, tassi di errore (fedeltà) e tolleranza agli inibitori della PCR diversi".

La progettazione di primer che si riconoscono ai modelli di DNA a una temperatura prevista con elevata specificità e l'ottimizzazione della composizione della miscela di reazione pone le prossime sfide.

"Il successo della PCR si basa sulla capacità della reazione di mantenere un basso rapporto di legame di primer non specifico e pertanto la temperatura di ricottura diventa un fattore critico che deve essere ottimizzato", afferma Hunter. "Inoltre, i componenti del tampone PCR (pH, sale, Mg2+, primer e concentrazione dell'enzima, che svolgono tutti un ruolo importante nelle prestazioni della reazione) devono essere considerati e potrebbero richiedere un'ottimizzazione."

L'amplificazione non specifica generalmente si verifica quando i primer si legano a sequenze per le quali non sono progettati. Ciò si traduce in prodotti non desiderati.

“Il primer design è sia un’arte che una scienza. Non è importante solo la giusta concentrazione di primer, ma anche la giusta sequenza di primer”, afferma Hunter. "Fortunatamente, ci sono molti strumenti software gratuiti per la progettazione di primer online che possono essere utilizzati per la progettazione di primer per PCR, ma non sorprenderti se ti ritrovi a dover testare una manciata di set di coppie di primer prima di trovare la giusta combinazione."

Un modo per evitare un'amplificazione non specifica è preparare la miscela di reazione sul ghiaccio finché non si è pronti a inserire la provetta o la striscia PCR nel termociclatore. La bassa temperatura riduce l'attività della DNA polimerasi diminuendo la probabilità che i primer si leghino in modo impreciso. Nonostante questa precauzione, è possibile che vengano comunque sintetizzati prodotti indesiderati.

Un'ulteriore soluzione per contrastare l'amplificazione non specifica consiste nell'utilizzare una DNA polimerasi hot-start. La DNA polimerasi hot-start è modificata chimicamente per essere inattiva a temperatura ambiente e impedire l'amplificazione non specifica. I nucleotidi vengono legati insieme dall'enzima modificato solo dopo che si è verificata una fase di attivazione del calore. Ciò consente l'assemblaggio della reazione PCR a temperatura ambiente, senza la possibilità di prodotti spuri e senza formazione di dimeri di primer. Un ulteriore vantaggio della PCR hot-start è che le condizioni del ciclo di reazione senza attivazione del calore possono essere utilizzate come controllo negativo.

Il multiplexing è la capacità di rilevare una serie di condizioni o fattori in un singolo test, invece di condurre test individuali per ciascun parametro.1 Migliora la produttività, riduce i costi dei test e migliora l'efficienza della cura del paziente.

Il multiplexing è spesso messo in discussione dalla progettazione dei primer. I primer per PCR multiplex devono essere altamente selettivi per il sequenziamento del target con temperature di fusione costanti che producono ampliconi di lunghezza uniforme. Ciò richiede un calcolo accurato durante la progettazione dei primer. Se progettati in modo improprio, i primer formano omo- o etero-dimeri o amplificano sequenze fuori bersaglio.