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La fissazione con metanolo è il metodo di scelta per le goccioline

Communications Biology volume 6, Numero articolo: 522 (2023) Cita questo articolo 2289 Accessi 1 Citazioni 24 Dettagli metriche altmetriche Una correzione dell'editore a questo articolo è stata pubblicata il 13 giugno

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 522 (2023) Citare questo articolo

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Il principale passaggio critico nella trascrittomica unicellulare è la preparazione del campione. Sono stati sviluppati diversi metodi per preservare le cellule dopo la dissociazione per separare la gestione dei campioni dalla preparazione delle librerie. Tuttavia, l'idoneità di questi metodi dipende dai tipi di cellule da elaborare. In questo progetto, eseguiamo un confronto sistematico dei metodi di conservazione per RNA-seq unicellulare basato su goccioline su cellule neurali e gliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte. I nostri risultati mostrano che mentre il DMSO fornisce la massima qualità cellulare in termini di molecole di RNA e geni rilevati per cellula, influenza fortemente la composizione cellulare e induce l'espressione di geni di stress e apoptosi. Al contrario, i campioni fissati con metanolo mostrano una composizione cellulare simile ai campioni freschi e forniscono una buona qualità cellulare e piccoli errori di espressione. Nel loro insieme, i nostri risultati mostrano che la fissazione del metanolo è il metodo di scelta per eseguire esperimenti di trascrittomica a cellula singola basati su goccioline su popolazioni di cellule neurali.

I metodi di trascrittomica unicellulare (scRNA-seq) hanno rivoluzionato il modo in cui studiamo ad alto rendimento l'espressione dei geni negli individui, nei tessuti e persino nelle malattie1,2,3. In precedenza, gli studi si limitavano a identificare i cambiamenti nei livelli di espressione dei geni in massa, cioè nella popolazione di cellule che componeva un particolare campione. Pertanto, questi approcci combinano due effetti diversi: cambiamenti nella composizione cellulare del campione di interesse e cambiamenti nell’espressione dei geni all’interno delle singole cellule. Ora, scRNA-seq consente di valutare questi due effetti in modo indipendente e può rilevare sia i cambiamenti nella composizione cellulare4,5 sia l'espressione di geni in tipi cellulari specifici6,7.

Nonostante la popolarità dei metodi scRNA-seq, ci sono ancora diverse sfide tecniche irrisolte. Ad esempio, la dissociazione delle cellule da un tessuto e l'ottenimento di una buona sospensione cellulare, necessaria per scRNA-seq, è altamente tessuto-specifica e può richiedere l'uso di diverse strategie tra cui digestione enzimatica, disgregazione meccanica, cellule attivate dalla fluorescenza smistamento e altre tecnologie8,9,10,11,12. Di conseguenza, la preparazione dei campioni per scRNA-seq può richiedere diverse ore, il che rende più conveniente elaborarli in momenti successivi. A parte le difficoltà tecniche, la conservazione delle cellule è importante anche se dobbiamo dissociare la dissociazione del campione e l'elaborazione per altri motivi come la spedizione dei campioni a una struttura esterna o se vogliamo raccogliere più campioni ed elaborarli insieme in un secondo momento per risparmiare tempo o denaro. In tutti questi casi, i ricercatori vorrebbero preservare questi campioni in modo da ridurre al minimo le differenze nella composizione cellulare e nell’espressione genica delle singole cellule rispetto al campione originale. Cioè, il miglior metodo di conservazione sarà quello che ha il minor impatto sulla composizione cellulare del campione e sul profilo trascrittomico delle singole cellule.

Sono già stati sviluppati diversi metodi di conservazione cellulare per superare questo problema e separare la gestione dei campioni dalla preparazione delle librerie. Tra questi, troviamo soluzioni sia fatte in casa che commerciali, tra cui la fissazione del metanolo13,14, il ditio-bis succinimidil propionato15, la crioconservazione del dimetilsolfossido (DMSO)16,17, l'acetico-metanolo (ACME)10, la paraformaldeide18, CellCover17 e vivoPHIX19. Questi metodi mirano a mantenere la composizione del campione e la qualità dell'RNA delle cellule. Tuttavia, considerando che la preparazione del campione è tessuto-specifica, ci aspettiamo che diversi metodi di conservazione possano essere ottimali per campioni diversi. Molti di questi protocolli sono stati testati solo su linee cellulari o cellule facili da ottenere come le cellule del sangue periferico e quindi non è chiaro come siano le loro prestazioni in cellule difficili da dissociare o potenzialmente danneggiate durante la dissociazione. In particolare, nessuno dei metodi precedenti è stato testato su neuroni maturi o su neuroni derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC), che sono la principale fonte di cellule neurali per lo studio dei meccanismi molecolari che guidano le malattie neurologiche20.

 = 0.8), although ACME and vivoPHIX samples have slightly lower correlations with all other samples (Supplementary Fig. 7). This lower correlation can be explained by global or cell-type-specific changes in gene expression but also by compositional biases. To investigate this further, we generated pseudobulk counts for each of the clusters for each sample separately and performed a correlation analysis at the cluster level. Our analyses show that the fixation method induces biases in the clustering of cell populations across samples (Supplementary Fig. 8). However, the high similarity between different clusters, i.e., NPC populations, makes cell clusters preserved with a particular method cluster together. To address this issue, we evaluated the clustering of samples for each cell cluster independently using sigclust229, a statistical method designed to test the statistical significance of hierarchical clustering. As can be seen in Fig. 5, in all cases methanol samples clustered with fresh samples. In contrast, in 8 of the 12 cell populations identified, several vivoPHIX and ACME samples cluster separately from fresh samples. This analysis thus confirms that the overall expression profile of methanol-fixed cells in each cluster is more similar to that of fresh cells than that of cells preserved using other methods./p> = |0.58| and an adjusted Wald test P value <0.05. vivoPHIX and methanol samples have more DEGs across clusters, while the number of DEG in DMSO is close to zero./p>0.58 are available in Supplementary Data 6 and in Fig. 6c. To assess if the different fixation/preservation methods introduced biases in the expression of particular gene sets, we investigated the biological processes associated to up and downregulated genes using the enrichr function of the GSEApy package47. For this analysis, we used all genes that were consistently up- or downregulated across at least four cell types for each fixation/preservation method. Only gene sets with at least ten genes were analyzed. As background set for the enrichment analysis, we provided all genes expressed in the dataset which had at least 445 UMIs, which is the minimum expression among the DEGs identified. Across all comparisons, we did not identify any significantly overrepresented gene ontology term (hypergeometric test adjusted P value <0.001)./p>