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Jun 08, 2023

Variazione trascrizionale in Babesia gibsoni (isolato di Wuhan) tra colture in vivo e in vitro nello stadio del sangue

Parassiti e vettori volume 16, numero articolo: 268 (2023) Cita questo articolo 1 Altmetric Metrics dettagli Babesia gibsoni, l'agente eziologico della babesiosi canina, appartiene al phylum Apicomplexa.

Parassiti e vettori volume 16, numero articolo: 268 (2023) Citare questo articolo

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La Babesia gibsoni, l'agente eziologico della babesiosi canina, appartiene al phylum Apicomplexa. Lo sviluppo della tecnologia delle colture in vitro ha guidato il progresso della ricerca in vari tipi di studi omici, inclusa l'analisi trascrittomica di Plasmodium spp. tra ambienti in vitro e in vivo, il che ha spinto all'osservazione di antigeni diagnostici e allo sviluppo di vaccini. Tuttavia, nessuna informazione su Babesia spp. potrebbero essere ottenuti a questo proposito, il che ostacola notevolmente l'ulteriore comprensione della crescita e dello sviluppo dei parassiti nello stadio sanguigno.

In questo studio, sono stati osservati cambiamenti considerevoli nella morfologia e nell'infettività di B. gibsoni coltivato in vitro continuo (isolato di Wuhan) rispetto ai parassiti in vivo. Sulla base di questi cambiamenti, B. gibsoni (isolato di Wuhan) è stato raccolto sia da colture in vivo che in vitro, seguite dall'estrazione dell'RNA totale e dal sequenziamento del trascrittoma Illumina. I geni espressi differenzialmente (DEG) acquisiti sono stati convalidati utilizzando qRT-PCR e quindi annotati funzionalmente attraverso diversi database. Il gene con la maggiore sovraregolazione dopo la coltura in vitro è stato clonato dal genoma di B. gibsoni (isolato di Wuhan) e caratterizzato mediante western blotting e test di immunofluorescenza indiretta per rilevare la forma nativa e la localizzazione cellulare.

Attraverso la coltivazione in laboratorio, sono state osservate molteplici forme di parassiti e l'infettività dei parassiti coltivati ​​in vitro nei cani è risultata inferiore. Sulla base di questi cambiamenti, è stato condotto il sequenziamento del trascrittoma Illumina, dimostrando che 377 unigeni erano sovraregolati e 334 unigeni erano sottoregolati. In particolare, è stata esaminata una famiglia di fattori di trascrizione AP2, essenziale per tutti gli stadi di sviluppo dei parassiti, e sono stati testati i cambiamenti trascrizionali in questi membri della famiglia. Pertanto, è stato selezionato il nuovo gene del fattore di trascrizione AP2 (BgAP2-M) con la massima espressione sovraregolata dopo l'adattamento in vitro. Questo gene comprende una struttura di lettura aperta (ORF) di 1989 paia di basi che codificano per una proteina a lunghezza intera di 662 aminoacidi. BgAP2-M contiene un dominio AP2 e un dominio conservato ACDC, che potrebbero essere coinvolti nella biologia nucleare dei parassiti. Gli anticorpi policlonali preparati contro i peptidi BgAP2-M hanno inoltre rilevato una dimensione nativa di ~ 73 kDa e sono stati localizzati nei nuclei di B. gibsoni.

Questo studio presenta per la prima volta un’analisi approfondita del trascrittoma di B. gibsoni in vivo e in vitro, contribuendo a una comprensione dettagliata degli effetti dei cambiamenti ambientali sulla crescita e sullo sviluppo dei parassiti nella fase del sangue. Inoltre, fornisce anche un'indagine più approfondita per i diversi membri della famiglia dei fattori di trascrizione ApiAP2 come vari regolatori dello stadio di vita in Babesia spp.

Le specie Babesia sono emoprotozoi intraeritrocitici obbligati classificati tassonomicamente nel phylum Apicomplexa, classe Piroplasmea, ordine Piroplasmida e famiglia Babasidae [1,2,3]. Babesia gibsoni è un parassita emoprotozoario che causa i sintomi tipici della babesiosi canina come anemia emolitica, emoglobinuria, shock ipotensivo e morte [4,5,6]. Questo organismo è trasmesso anche per via transovarica da Haemaphysalis longicornis, che è ampiamente distribuito nelle zone selvagge collinari [7,8,9,10].

Sono stati istituiti sistemi di coltura in vitro di laboratorio per vari parassiti apicomplexan tra cui Babesia bovis, B. bigemina, B. gibsoni, B. orientalis, Plasmodium falciparum e P. knowlesi [11,12,13,14,15]. A causa di numerosi fattori ambientali in vitro, inclusi fattori fisici, nutrizionali e immunologici, distinti da quelli in vivo, i parassiti tendono a mostrare cambiamenti visibili e significativi nella morfologia, nell’infettività e nella virulenza. Ad esempio, nell’isolato di B. gibsoni Oita, la coltivazione in vitro a lungo termine ha prodotto parassiti più grandi e multiformati negli eritrociti ospiti e una minore infettività dei parassiti nei cani [13, 16]. Pertanto, si ritiene che i cambiamenti trascrizionali più profondi siano provocatori e significativi. Tuttavia, tali cambiamenti nei geni influenzati dalla coltura in vitro sono stati studiati sia in P. falciparum che in P. knowlesi [17,18,19,20]. Tali alterazioni occasionalmente indicano l'adattamento dei parassiti all'ambiente circostante, producendo una migliore sopravvivenza e propagazione [21]. Ad esempio, alcuni geni dello stadio sessuale (antigene gametico 27/25) e altri correlati all'invasione e alla crescita dello stadio asessuale (MSP7, DOC2 e CLAMP) sono stati identificati con variazioni di trascrizione relativamente grandi perché hanno molte meno probabilità di essere trasmessi a nuovi vettori di zanzare e con maggiori probabilità di invadere gli eritrociti ospiti in ambienti in vitro [17, 19]. In particolare, anche vari fattori di trascrizione ApiAP2 hanno subito un certo grado di cambiamento trascrizionale. Questa famiglia di proteine, con da uno a tre domini che legano il DNA, è stata determinata come la più grande famiglia di fattori di trascrizione negli organismi apicomplexa e regola con precisione tutti gli stadi di sviluppo dei parassiti [22, 23]. In P. falciparum, è stato ben documentato che due fattori di trascrizione AP2, PF3D7_1222600 (PfAP2-G) e PF3D7_1222400 (PfAP2-G4), presentano mutazioni senza senso con perdita di funzione con codoni di stop prematuri, che portano a un'enorme repressione della trascrizione genetica durante la gametocitogenesi . Un altro fattore di trascrizione AP2 (PF3D7_1342900, PfAP2-HS) è stato rilevato con tre mutazioni non senso, tutte residenti a monte dei domini AP2 previsti e troncate la proteina a lunghezza intera. Queste mutazioni influenzate dalla trascrizione in PfAP2-HS sono probabilmente il risultato di una migliore tolleranza alle fluttuazioni di temperatura negli ambienti in vitro [18]. Inoltre, studi recenti hanno osservato un aumento dei livelli di trascrizione di un gene AP2 di funzione sconosciuta (PF3D7_0420300), che potrebbe essere coinvolto nella riproduzione asessuata [19].